Исследование почвы (часть 2)
На третьем этапе изучают колонии, выросшие на среде Эндо. Отбирают колонии, типичные для бактерий группы кишечных палочек, готовят из них мазки, красят по Граму, микроскопируют. При обнаружении в мазках коротких полиморфных грамотрицательных палочек производят высев из этих колоний на среду Кесслер для подтверждения газообразования в чистой культуре.
Метод бродильных проб с использованием ТТХ. Метод основан на способности бактерий группы кишечных палочек восстанавливать бесцветный ТТХ в трифенилформазан, выпадающий в виде осадка и придающий среде кирпично-красный цвет. Кишечная палочка довольно устойчива к действию формазана, в то время как развитие сопутствующей микрофлоры им несколько тормозится.
Для приготовления среды с ТТХ к 100 мл МПБ добавляют 0,5 г лактозы. После ее растворения устанавливают рН 6,2—6,4. Среду разливают в пробирки по 9 мл и в колбы по 50 мл, стерилизуют при 112°С в течение 20 мин. После охлаждения среду помещают в термостат на сутки для проверки на стерильность. Перед посевом в каждую пробирку с лактозным бульоном вносят по 0,3 мл 2%-ного водного раствора ТТХ, а в каждую колбу—по 1,5 мл. Раствор ТТХ хранят в темной склянке; срок его годности — 2 мес.
Почвенную суспензию и ее разведения готовят, как было описано выше. 10 мл основного разведения (1:10) засевают в 50 мл лак-тозного бульона с ТТХ. Если для анализа взяты меньшие количества почвы (0,001—0,1 гит. д.), то засев производят путем внесения 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в 9 мл той же среды. Последующее исследование проводят так же, как и при методе бродильных проб с использованием среды Кесслер.
Метод мембранных фильтров. При исследовании чистых почв по 1 мл разведений (1 : 10, 1 : 100 и 1 : 1000) пропускают через мембранные фильтры № 3. Если исследуют загрязненную почву, то фильтруют разведения от 1 : 1000 до 1 : 1 000000. При фильтрации неразведенной 10%-ной почвенной суспензии на мембранных фильтрах остается значительное количество почвенных частиц, мешающих выявлению кишечной палочки. В связи с этим рекомендуют на мембранный фильтр № 3 наложить планктонный фильтр № 6 и фильтровать почвенные суспензии через оба фильтра. Затем оба фильтра наносят на среду Эндо. Дальнейший ход исследования такой же, как и при определении коли-титра воды методом мембранных фильтров.
Полный микробиологический анализ почвы. В полный микробиологический анализ почвы кроме методов определения микробного числа и коли-титра входит определение титра анаэробов (титра Cl. perfringens), титра Proteus, количество термофилов.
Определение титра Cl. perfringens. Для определения титра Cl. perfringens производят посев в желсзосульфитную среду Вильсон — Блера или в обезжиренное молоко.
Перед посевом в эти среды пробирки с разведениями почвенной суспензии прогревают в водяной бане при 80°С в течение 20 мин.
Для посева в среду Вильсон — Блера стерильной пипеткой берут по 1 мл соответствующего разведения почвенной суспензии и переносят в пробирку с расплавленной и охлажденной до 45°С железо-сульфитной средой. Почвенную суспензию равномерно распределяют в среде, вращая пробирки между ладонями. Посевы выращивают 12—18 ч при 43°С. О наличии Cl. perfringens судят по росту черных колоний, нередко разрывающих среду вследствие газообразования в первые 18 ч роста. В более поздние сроки такую же картину могут давать и другие анаэробы. Для определения титра Cl. perfringens необходимо засевать 4 разных разведения, а титр определять по предельному разведению, дающему рост этого микроба.
Посев в обезжиренное молоко известен как «энтеритный» тест. Он основан на способности Cl. perfringens быстро развиваться в молоке (4—6 ч) и вызывать его свертывание с образованием на поверхности тубчатого сгустка с отделением сыворотки и сильным газообразованием.
Определение титра Proteus. По 0,1 мл приготовленных разведений вносят в конденсационную воду скошенного МПА. Пробирки помещают в термостат при 37°С на 24—48 ч. Рост Proteus регистрируют по образованию тонкой, вуалеобразной пленки на скошенной поверхности агара. Титр протея определяют по пробирке с наибольшим разведением почвенной суспензии, в которой обнаружен рост протея.
Определение количества термофилов. Разведения почвенной суспензии вносят в стерильные чашки, затем заливают расплавленным и охлажденным МПА. Посевы выдерживают при 60°С в течение 24 ч, подсчитывают количество выросших колоний и делают пересчет на 1 г почвы.